研究人員首先構(gòu)建了兩個分裂蛋白N65和66C，這兩個大小相當(dāng)?shù)牡鞍祝?/span>N65為10.3 kDa, 66C為13.5 kDa）在彼此靠近時會自發(fā)地發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，當(dāng)與底物furimazine（FMZ）孵育時，可以催化產(chǎn)生明亮穩(wěn)定的發(fā)光信號。例如，只有當(dāng)HEK細胞中同時轉(zhuǎn)染兩種結(jié)構(gòu)的分裂蛋白后，在細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中才能檢測出發(fā)光信號。然后研究人員利用這個工具來探究不同的細胞培養(yǎng)方式間蛋白質(zhì)的交換，包括直接共培養(yǎng)和間接培養(yǎng)。在直接培養(yǎng)模式中，無論是利用Hela細胞直接共培養(yǎng)體系還是人源性膠質(zhì)瘤細胞系U87和永生化人源星形膠質(zhì)細胞的直接共培養(yǎng)體系中均可以在細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中檢測到N65和66C兩者的蛋白轉(zhuǎn)移。此外，在人源性膠質(zhì)瘤細胞系U87和永生化人源星形膠質(zhì)細胞的間接共培養(yǎng)體系中，也可以在細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中檢測到明顯的發(fā)光信號。這些結(jié)果表明通過分裂的報告基因可以監(jiān)測細胞通訊間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。

分裂報告基因構(gòu)建和功能蛋白轉(zhuǎn)移檢測

細胞通訊間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移很可能是通過胞外囊泡運輸實現(xiàn)，為了驗證這一猜想，研究人員收集了高濃度的胞外囊泡，然后直接將胞外囊泡添加到轉(zhuǎn)染了N65或66C的HeLa細胞中，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)Hela細胞內(nèi)和培養(yǎng)基中均可以檢測到發(fā)光信號。此外，為了進一步證明該工具的多功能性，研究人員將核定位信號（nuclear localization signal, NLS）融合到N65結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)兩種NLS結(jié)構(gòu)的直接共培養(yǎng)沒有導(dǎo)致發(fā)光信號的顯著增加，NLS-N65與正常66C HEK細胞直接共培養(yǎng)時，發(fā)光信號明顯增加。最后，研究人員還在動物體內(nèi)驗證了該工具的實用性。先將乳腺癌細胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染為帶有N65或66C結(jié)構(gòu)，然后在無胸腺裸鼠皮下注射MDAMB-231-N65或MDA-MB-231-66C細胞或兩者混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與只有一種細胞的對照組相比，在由兩種細胞組成的腫瘤中可以檢測到強烈的發(fā)光信號，且這種信號隨著時間的推移而增加。這也表明該工具可以用于研究體內(nèi)的細胞通信。

胞外囊泡介導(dǎo)的蛋白傳遞和體內(nèi)蛋白傳遞

綜上所述，研究人員開發(fā)了一種檢測蛋白質(zhì)直接、間接或胞外囊泡介導(dǎo)的通信功能傳遞的方法，展示了該方法在體內(nèi)和體外的功能性和適應(yīng)性。這一工具將有助于研究人員評估和改善細胞通信和功能性胞外囊泡介導(dǎo)的傳遞，并進一步幫助我們理解體外和體內(nèi)的細胞通信。

參考文獻

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